I modèles animaux en recherche biomédicale Qu’est ce qu’un «bon»modèle ?





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date de publication15.02.2017
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Modèles animaux et Imagerie
Frédéric PAIN

Institut de Physique Nucléaire d’Orsay

Groupe Interfaces Physique Biologie

Université Paris XI, Orsay

mél : pain@ipno.in2p3.fr

Au cours des quinze dernières années de nombreux modèles animaux mimant les pathologies humaines ont été mis au point, grâce auxquels de nouvelles approches fondamentales et thérapeutiques de ces maladies ont été développées. Bien que, par soucis d’éthique, d’importants efforts soient faits pour remplacer les études animales par des cultures cellulaires ou encore par des modèles informatiques, rongeurs et primates restent des acteurs incontournables de la mise au point de nouveaux traitements. En particulier, la présence chez la souris de gènes équivalents à ceux de l’homme et la possibilité de manipuler simplement le génome de la souris ont conduit à une multiplication du nombre de modèles murins. La caractérisation et la réalisation d’études in vivo sur ces modèles requièrent la mise en œuvre de techniques adaptées. Développées initialement pour des études cliniques, ces techniques ont été adaptées au cours de la décennie passée aux études sur modèles animaux. Après avoir présenté la notion de modèle animal et le cadre tant scientifique qu’éthique de leur utilisation en recherche biomédicale, nous présenterons les contraintes propres à l’étude de ces modèles par les différentes modalités d’imagerie, puis nous examinerons les développements instrumentaux en cours en nous appuyant sur les premiers résultats biologiques obtenus.

I - Modèles animaux en recherche biomédicale




Qu’est ce qu’un « bon »modèle ?



Dans la démarche scientifique biomédicale, le modèle expérimental intervient à différents niveaux d’expérimentation, du microscopique, (molécules, organites, cellules) au macroscopique (organe, organisme dans son ensemble, voire population d’organismes). Il s ’agit d’obtenir une représentation simplifiée d’un système biologique qu’il n’est pas possible d’étudier directement pour des raisons éthiques, techniques ou économiques. En pathologie, le modèle animal joue un rôle clé puisqu ’il va permettre à partir d’une « reproduction » d’une pathologie humaine de tester des hypothèses sur les causes, les mécanismes et la thérapie de ces maladies. Cependant pour garder une démarche rigoureuse, le modèle doit être validé précautionneusement et doit répondre à un certain nombre de critères. En premier lieu, il doit satisfaire au critère d’isomorphisme, c ’est-à-dire que les symptômes observés chez l’animal doivent être semblables à ceux observés chez l’humain. Le modèle doit également présenter des mécanismes et des causes identiques à eux observés chez l’homme, dans la mesure ou ceux-ci sont connus. Enfin, le modèle doit répondre de la même manière que l’homme aux différents traitements, aussi bien positivement que négativement. Par exemple, l’administration de L-dopa doit réduire les symptômes Parkinsoniens chez un modèle animal qui a pour finalité de mimer cette pathologie. La limite de l’analogie dépend alors de la posologie qui doit être adaptée à l’animal en tenant compte des différences physiologiques (masse, débit sanguin) avec l’homme. Evidemment il n’existe pas de modèle parfait et il faut se garder d’extrapoler trop directement à l’homme des résultats obtenus chez le rongeur En tout état de cause, l’étude des modèles aboutit à mieux connaître les mécanismes et les causes d’une pathologie et conduit donc souvent à affiner le modèle initial [1].

Obtention d’un modèle animal



On peut distinguer deux catégories de modèles animaux : les modèles « spontanés » et les modèles « construits » [2]. Il existe par exemple des lignées de poulets ou de rats qui présentent spontanément des états épileptiques très semblables aux crises observées chez l’homme. Ces crises épileptiques sont déclenchées simplement par un stimulus visuel ou auditif. Cette lignée de poulets « épileptiques » constitue un très bon outil d’étude puisqu’elle reproduit les symptômes et les mécanismes de la crise épileptique et ce de manière tout à fait contrôlée. Toutefois les modèles spontanés sont rares et il est souvent nécessaire de « construire » son modèle. On peut alors selon les cas faire appel à une méthode lésionnelle ou à des méthodes chimiques comme l’injection localisée d’un produit neurotoxique pour reproduire la dégénérescence neuronale progressive de la maladie de Parkinson. Enfin, les modèles génétiques s’appuient sur des modifications du patrimoine génétique en éliminant ou en surexprimant un ou plusieurs gènes (on parle de souris « knock-out » ou « knock-in »). Ces modèles génétiques ont connu un essor très important au cours des années passées du fait des progrès techniques importants dans la manipulation du génome et de la connaissance relativement bonne du génome de la souris qui présente de nombreuses homologies avec le génome humain [3, 4].

Expérimentation animale et éthique



L’expérimentation animale ne peut pas faire l’économie d’une réflexion éthique approfondie. De fait, dès 1959, deux chercheurs britanniques (William Russel et Rex Burch) ont proposé une base éthique aux expériences biomédicales mettant en jeu des animaux [5]. Ces règles connues sous le nom des 3 R pour « Remplacement, Réduction et Raffinement » sont désormais inscrites dans les textes de lois européennes [6]. Il faut :

- Remplacer l’expérimentation animale aussi souvent que possible
par la modélisation, les cultures cellulaires ou les modèles informatiques (dans le cadre de l’enseignement de la physiologie il existe notamment un kit virtuel de la dissection de la grenouille [7]).
- Réduire le nombre des animaux mis en jeu dans la mesure du possible
(bibliographie pour éviter les expériences redondantes, mesure simultanée d’un maximum de paramètres, minimum de statistique significative).
- Raffiner les expériences en choisissant des protocoles qui minimisent le stress et la douleur et en améliorant les conditions d’élevage.
Au-delà de ces règles éthiques, on a assisté au cours des dernières décennies à une prise de conscience morale des chercheurs parallèlement à une montée en puissance des mouvements d’opinions pro-animaux. On ne peut que se féliciter du développement de solutions alternatives, notamment via la mise au point de nouvelles techniques moléculaires in vitro, qui ont conduit à une diminution très nette du nombre d’animaux utilisés. En France on est passé de 7 Millions en 1980 à 2,6 Millions en 1997, dont 85% sont des rongeurs ou des lapins [6]. Cependant, pour certaines études, et notamment pour l’évaluation pré-clinique des nouvelles thérapeutiques, il n’est pas possible de s ’affranchir des études sur modèles animaux.
II - Imagerie des modèles animaux : contraintes, techniques

perspectives

Intérêt des techniques d’imagerie



Pour caractériser et étudier les modèles, il est indispensable de disposer d’outils adaptés. De nombreuses techniques, allant de l’observation du comportement à la mesure de paramètres physiologiques précis, ont été développées par le passé. Les techniques histologiques, impliquant le sacrifice de l’animal, puis l’examen au microscope ou par imagerie planaire de fines coupes de tissus, restent couramment employées. Ces techniques ex vivo présentent l’inconvénient majeur du sacrifice de l’animal, qui implique l’utilisation de nombreux animaux dans des procédures longues et coûteuses. Afin de répondre à cette difficulté les techniques d’imagerie in vivo se sont progressivement imposées au cours de la décennie passée. En effet, l’imagerie tomographique permet d’obtenir sur un même et unique animal des images 2D ou 3D et ce, sans porter atteinte à son intégrité physique (hormis l’anesthésie et, pour certaines modalités, l’injection d’un traceur ou d’un agent de contraste). Cet aspect non invasif de l’imagerie autorise un suivi dans le temps d’un même animal (on parle d’études « longitudinales ») et donc l’étude du décours temporel d’une maladie ou d’un traitement sur un individu, et permet de s ’affranchir des différences interindividuelles qui nécessitent habituellement une normalisation.

Contraintes propres à l’imagerie animale
L’imagerie du petit animal (rat et souris) connaît donc un développement rapide qui est rendu possible par des avancées technologiques importantes. En effet, l’imagerie animale présente des contraintes spécifiques qui autorisent rarement la transposition immédiate des techniques d’imagerie clinique.
La contrainte la plus évidente est liée aux dimensions réduites des structures étudiées. A titre d’exemple, la différence d’échelle entre les structures cérébrales de l’homme (quelques cm) et du rat (quelques 100µm voire quelques 10µm) impose une amélioration drastique de la résolution spatiale. L’obtention d’informations anatomiques chez le rongeur impose d’atteindre des résolutions spatiales de quelques centaines de µm à quelques dizaines de µm et la mesure de paramètres fonctionnels est possible pour des résolutions spatiales de l’ordre du mm. Ce gain en résolution s’accompagne d’une diminution dramatique de la « quantité d’information » mesurable. En effet, si l’on gagne un facteur 10 en résolution spatiale sur les 3 dimensions, on aura un volume analysé élémentaire (ou « voxel ») qui sera 1000 fois plus petit et donc, à concentration égale, un nombre de molécules détectables 1000 fois plus petit. Il est donc nécessaire de mettre au point des systèmes de très haute sensibilité, ce facteur demeurant encore souvent le facteur limitant [8]. Enfin, il faut considérer une troisième contrainte qui découle de la nécessité d’anesthésier l’animal. En effet, s ’il est possible de demander à un patient (de bonne volonté) de demeurer immobile dans un scanner ou un IRM, il est indispensable d’immobiliser un animal durant l’acquisition de l’image. Or l’anesthésie présente différents inconvénients : d’origine chimique, elle peut perturber les phénomènes étudiés et elle ne permet pas de réaliser des études qui nécessitent la conscience de l’animal pour réaliser une tâche (manger, boire, parcourir un labyrinthe).

Différentes modalités pour mesurer différents paramètres complémentaires



Les différentes techniques d’imagerie pour l’étude des rongeurs et primates ont pris une importance considérable au cours de la dernière décennie. Ces techniques donnent en effet accès à de nombreux paramètres anatomiques, physiologiques (le fonctionnement biologique d’un organisme ou d’un organe), pharmacologiques (le suivi cinétique de la fixation d’une molécule). Récemment le terme d’ « imagerie moléculaire » a été proposé pour décrire l’imagerie des phénomènes à une échelle moléculaire comme, par exemple, l’expression d’un gène ou l’action d’une enzyme.
Parmi les différentes modalités d’imagerie, on peut distinguer deux grandes familles : la première regroupe l’imagerie X, l’échographie ultrasons et l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et s’appuie sur la détection de signaux intrinsèques à l’organisme étudié : atténuation du rayonnement X par les différents tissus, échos ultrasonores ou vélocimétrie Doppler, propriétés magnétiques locales. La seconde concerne les techniques qui se fondent sur la détection après injection ou inhalation d’un traceur spécifique d’une cible biologique. Il s’agit principalement de l’imagerie nucléaire qui repose sur la détection de molécules radiomarquées et des techniques optiques qui s’appuient sur la détection de molécules émettrices de photons optiques. Certaines modalités d’IRM en cours de développement ont également recours à l’injection de traceurs.

Imagerie X : imagerie anatomique pour le criblage phénotypique



L’imagerie X pour le petit animal a été développée récemment pour répondre à un besoin de rapidité dans l’analyse des très nombreux modèles génétiques. Les chercheurs veulent en effet savoir comment les mutations génétiques introduites affectent les caractéristiques anatomiques, fonctionnelles et métaboliques du modèle. Les contraintes en résolution spatiale liées aux faibles dimensions des structures d’intérêt ont conduit au développement d‘ imageurs spécifiques (source X basse énergie et détecteur CCD/écran de phosphore) qui présentent une résolution spatiale inférieure à 50µm. Le développement du premier microtomographe X [9] est le fruit d’une collaboration étroite entre biologistes et physiciens de l’Université de Duke (Oak Ridge, USA) qui possède une très importante « collection » de souris transgéniques. L’analyse rapide (il faut environ 15 minutes pour obtenir une image 3D avec une résolution de 50µ) du phénotype des ces souris permet un gain de temps très important en comparaisons des techniques histologiques car il n’est plus nécessaire de disséquer une souris pour caractériser ses organes internes et une rationalisation du développement des modèles et de leur analyse [10]. Cette technique rapide et relativement peu coûteuse présente cependant l’inconvénient de présenter un contraste peu marqué pour les tissus mous. Dans ce cas l’utilisation des ultrasons constitue une alternative intéressante.
Ultrasons : criblage phénotypique, imagerie Doppler et interven- tionnelle



L’utilisation de fréquences ultrasonores significativement plus élevées que celles utilisées en imagerie humaine (20 à 100MHz contre 2 à 12MHz chez l’homme) permet l’observation anatomique de la plupart des organes à l’exception du cerveau, des poumons et du squelette. Ce n’est que récemment grâce au développement de nouveaux capteurs polymères piézo-électriques que de telles fréquences ont pu être mises en œuvre. L’analyse des échos ultrasonores réfléchis par les tissus permet la visualisation de la morphologie des souris avec une résolution spatiale de l’ordre de quelques dizaines de µm. Elle permet également en utilisant les techniques de mesure Doppler de déterminer des paramètres fonctionnels concernant la micro-circulation sanguine (vitesse et sens de circulation) [11]. Enfin, la possibilité de visualiser en temps réel la souris dès le stade embryonnaire et avec une très bonne résolution spatiale permet l’étude du développement de l’embryon et la détermination précise du stade d’apparition d’anomalies génétiques [12, 13].
Malgré la légèreté de son instrumentation et son faible coût, l’imagerie ultrasonore reste encore marginale. Le principal inconvénient de la technique est lié à la diminution de la pénétration des ultrasons avec l’augmentation de leur fréquence. Ainsi au-delà de 80MHz, la technique est limitée à l’étude de structures superficielles comme l’œil par exemple.
L’IRM fournit des données anatomiques, fonctionnelles et pharmacologiques



Une dernière technique permet d’obtenir des informations anatomiques de très haute résolution spatiale : l’imagerie IRM. Concernant l’imagerie du petit animal on parle souvent de Microscopie par Résonance Magnétique. En effet, le défi pour transposer cette technique à l’imagerie animale est un gain en résolution considérable : les volumes élémentaires imagés sont de l’ordre de 50µm  50µm  500µm soit 10000 fois moins importants que chez l’homme. Les solutions techniques reposent sur le développement de gradient de champs magnétiques adaptés et l’utilisation de champs magnétiques intenses.
Par ailleurs, afin de conserver une sensibilité de détection raisonnable il est nécessaire de faire un compromis entre la durée de l’acquisition (on intègre le signal disponible sur des durées allant de quelques minutes à quelques heures) et la résolution temporelle. Selon le mode d’analyse des signaux IRM, on obtient une information anatomique de très haute résolution spatiale ou des informations dites « fonctionnelles » caractérisant le métabolisme énergétique ou la perfusion sanguine locale.
L’imagerie anatomique ou morphologique permet de caractériser la forme, le volume d’organes ou encore la structure des tissus [14]. L’IRM présente pour les tissus mous un contraste largement supérieur à celui observé pour l’imagerie X. L’une des applications majeures est le criblage phénotypique à haut débit des nombreux modèles murins [15]. Par ailleurs, l’IRM permet également de mesurer des paramètres fonctionnels, en s ’appuyant sur la modification de propriétés magnétiques locales liées au taux d’oxygénation de l’hémoglobine. On réalise alors des cartes d’activation cérébrale suite à un stimulus. De manière simpliste, l’objectif est de mieux comprendre le cheminement de l’information et l’organisation cérébrale. D’autre part, l’imagerie IRM a également été mise en œuvre pour tester de l’effet nouvelles molécules thérapeutiques sur le métabolisme énergétique ou le débit sanguin (par exemple sur des modèles d’accidents cérébraux vasculaires). Enfin, dans le cadre de « l’imagerie moléculaire » l’IRM peut également s ’appuyer sur l’injection d’agent de contraste Gd ou de marqueurs magnétiques (anticorps associé à une nanoparticule) [16].
L’IRM est donc une technique extrêmement riche qui, outre une information anatomique de très haute résolution, permet la mesure de nombreux paramètres physiologiques ou pharmacologiques. Cette technique présente cependant une résolution temporelle limitée par sa sensibilité relativement faible ainsi qu’un coût élevé. Il est néanmoins possible d’adapter les IRM cliniques sans toutefois égaler les performances des systèmes dédiés à l’imagerie du petit animal.
La seconde grande famille de techniques regroupe l’imagerie nucléaire et l’imagerie optique dont le point commun est de s’appuyer sur la détection, après injection par voie sanguine, de molécules marquées qui vont interagir de façon spécifique avec une cible biologique.

Radiotomographie : l’atout de la sensibilité et de la quantification



En imagerie nucléaire, on mesure au cours du temps la fixation spécifique d’un traceur radiomarqué, par un isotope + en Tomographie par Emission de Positron (TEP) ou un émetteur  en Tomographie par Emission MonoPhotonique (TEMP). On a ainsi accès à une information spatiale (où s’est fixé le traceur ?) et une information temporelle (quelle est la cinétique de fixation du traceur ?). La construction de la molécule spécifique d’une cible biologique et son marquage, généralement réalisé par substitution ou ajout d’un atome radioactif à la molécule initiale, requièrent l’intervention de chimistes et de radiochimistes. Les caméras TEP et TEMP cliniques présentant une résolution spatiale de plusieurs millimètres, un important travail instrumental a été initié au milieu des années 90 pour le développement d’imageurs dédiés, de résolution spatiale millimétrique, grâce à une architecture adaptée, plus compacte [17-20]. Sans rentrer dans les détails, cela a été rendu possible par les progrès instrumentaux des détecteurs de radioactivité au cours de la dernière décennie (cristaux scintillants et photodétecteurs).
L’imagerie nucléaire possède l’atout essentiel d’une excellente sensibilité puisqu’elle permet de quantifier des concentrations moléculaires jusqu’à 10-12 mole/l. De plus l’imagerie TEP animale bénéficie d’une très grande variété de molécules radiomarquées déjà développée pour l’imagerie clinique. Parmi ces différentes molécules, on peut distinguer le 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) qui est un analogue du glucose (substrat énergétique des cellules) marqué au fluor 18 (isotope+ de période radioactive ~ 2 heures). Après injection intraveineuse, cette molécule radiomarquée suit le même chemin métabolique qu’une molécule de glucose puis s ’accumule dans les cellules, à la différence du glucose qui va, lui, subir une cascade de réactions enzymatiques aboutissant à la production d’énergie utilisable par la cellule. Cette accumulation du traceur au cours du temps traduit le métabolisme énergétique local. Le FDG est également la molécule de référence pour l’étude des modèles du cancer puisque les cellules cancéreuses présentent un métabolisme énergétique plus élevé que celui des cellules saines. Il est donc possible de suivre et de caractériser le développement tumoral et d’évaluer différentes approches thérapeutiques. Cette technique a également été validée pour les études cardiaques. On voit sur la figure 1 une image TEP cardiaque 18F-FDG obtenue chez un rat normal (en haut) et chez un rat souffrant d’une insuffisance myocardique chronique, induite par ligature permanente de l’artère descendante antérieure gauche (en bas). L’interruption de la perfusion sanguine est responsable du sévère défaut de captation dans la région myocardique antéro-latérale du ventricule gauche, indiquant l’absence d’activité métabolique dans cette région nécrosée. Ce modèle a été utilisé pour l’évaluation de nouvelles thérapies angiogéniques et cellulaires de l’insuffisance cardiaque chronique. L’imagerie nucléaire possède par ailleurs un intérêt unique pour les études pharmacologiques, pour laquelle elle devrait tendre à remplacer les études ex vivo qui nécessitent le sacrifice de nombreux animaux. En effet, pour obtenir la biodistribution et la cinétique de fixation d’une molécule, ces études nécessitent le sacrifice de nombreux animaux. La figure 2 montre la caractérisation d’une mort neuronale progressive et sélective chez un rat modèle de la maladie de Huntington. Cette étude démontre l’intérêt de l’imagerie qui permet la reproduction d’une mesure chez un même animal à intervalles de temps choisis. La caractérisation in vivo de tels modèles permet alors d’explorer de nouvelles voies thérapeutiques, comme par exemple, dans le cas des maladies neurodégénératives, la greffe de neurones embryonnaires.
Enfin, on peut mesurer l’expression génique chez l’animal vivant grâce à la mise au point récente de systèmes de gènes rapporteurs dédiés à l’imagerie TEP. Ces gènes, introduits par transgénèse, sont placés sous le contrôle du même promoteur que le gène d’intérêt et s’expriment donc de la même façon que lui. La protéine codée par le gène rapporteur interagit avec un traceur radiomarqué judicieusement choisi et le “ piège ” localement, de sorte que la concentration du traceur est directement proportionnelle à l’expression du gène d’intérêt [21]. Cette technique est un premier pas vers l’imagerie de l’expression génique chez l’homme, et pourrait faciliter la mise au point de thérapies géniques ou l’étude de l’expression des gènes au cours du développement.



3 jours

post injection





5 jours

post injection



Figure 1 : Imagerie cardiaque TEP 18F-FDG : caractérisation de l’insuf-fisance cardiaque d’un rat modèle d’infarctus (en bas) comparé à un rat normal (en haut).

(Avec la permission de Roger Lecomte, Centre d'imagerie méta-bolique et fonctionnelle, Université de Sherbrooke, Canada)

Figure 2 : Caractérisation de la neuro-dégénérescence striatale pro-gressive chez un rat modèle de la maladie de Huntington (coupes frontales 3 et 5 jours après injection unilatérale d’un neurotoxique).

(Collaboration Institut de Physique Nucléaire Orsay et Service Hospitalier Frédéric Joliot, Orsay, CNRS CEA)



En résumé, l’imagerie nucléaire présente des atouts certains, en particulier son excellente sensibilité et la grande variété de traceurs disponibles qui permettent l’imagerie du métabolisme énergétique, de la pharmacocinétique de molécules d’intérêt et de l’expression génique. Cependant ces techniques demeurent coûteuses et nécessitent, en particulier pour la TEP, la mise en place d’une infrastructure lourde (Cyclotron, Service de radiochimie, imageur dédié, radioprotection).

Imagerie optique : l’émergence de nouvelles techniques in vivo


L’imagerie optique in vivo chez le petit animal s’est développée très récemment. On distingue les techniques de fluorescence qui s’appuient sur la détection de fluorochromes après excitation transcutanée par un laser et les techniques de bioluminescence qui reposent sur l’utilisation de molécules qui émettent naturellement des photons après injection d’un substrat donné. Dans les deux cas ces techniques sont particulièrement bien adaptées au suivi de cellules. On sait en effet construire des cellules qui vont synthétiser une molécule fluorescente (la plus connue est la Green Fluorescent Protein ou GFP) ou une « enzyme bioluminescente » comme la Luciférase. Il est alors possible dans les deux cas d’étudier une population de cellules en particulier de cellules tumorales humaines implantées chez la souris et qui produisent de la GFP ou de la Luciférase [22]. On peut alors caractériser au cours du temps le développement ou la régression du cancer, la présence de métastases, l’effet d’agents pharmaceutiques [23]. Ces techniques permettent également le suivi de l’expression génique sur le même principe que celui détaillé plus haut, le gène rapporteur pouvant être par exemple le gène codant pour la Luciférase [24].
Outre leur simplicité de mise en œuvre (la détection se fait généralement par une simple caméra CCD refroidie) et leur coût modéré, ces techniques présentent également l’avantage d’une résolution temporelle élevée bien adapté à l’étude des phénomènes cinétiques rapides. Néanmoins ces techniques d’imagerie 2D fournissent une information généralement qualitative et souffrent pour la bioluminescence ou l’utilisation de la GFP d’être limitées aux études des couches superficielles des tissus, du fait de la pénétration limitée de la lumière. Des résultats récents proposent la mise en œuvre d’une imagerie tomographique optique qui permettrait en partie de s’affranchir de ces contraintes.

Conclusion



Après une dizaine d’année de développements instrumentaux, l’imagerie du petit animal entre dans une seconde phase. Une première génération d’imageurs performants ont été mis en œuvre et franchissent les uns après les autres le stade de l’industrialisation (MicroTEP en 1997, Microtomographe X en 2000, systèmes optiques pour la bioluminescence en 2001). Au niveau international, les grands laboratoires privés et public sont en train de s’équiper et en France on assiste aux balbutiements de la mise en œuvre de plates-formes d’imagerie animale regroupant différentes modalités. L’imagerie du petit animal est un domaine dynamique à l’aspect interdisciplinaire très marqué regroupant chimistes biologistes, médecins, physiciens, industriels. Cependant, si les techniques ont d’ores et déjà dépassé le stade de la validation, l’imagerie doit encore faire ses preuves en termes de résultats biologiques. L’un des résultats attendu est une diminution significative du délai entre la découverte d’un agent pharmaceutique et sa mise sur le marché. De nombreux défis techniques demeurent et de nouvelles techniques notamment optiques vont très probablement émerger au cours des années à venir.

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